Resumo:

Leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira spp. Existem relatos de isolamento desta bactéria no trato genital de fêmeas, relacionado à abortamento e infertilidade no rebanho bovino. Já se sabe que a Leptospira presente nos órgãos reprodutivos de bovinos causa danos teciduais principalmente pela vasculite. Além disso, a leptospirose aguda produz níveis altos de citocinas durante a fase inicial de infecção. Entretanto, faltam estudos sobre a patogênese desse microrganismo no endométrio de vacas. Objetivou-se avaliar o perfil das citocinas inflamatórias após o desafio com Leptospira interrogans sorovar Hardjoprajitno e ao LPS de Escherichia coli produzidas pelo tecido uterino ex vivo coletados de vacas não gestantes e gestantes reativas sorologicamente ou não ao Teste de soroaglutinação microscópica (MAT). Foram utilizados 43 úteros com respectivas amostras de sangue coletadas de vacas mestiças, sendo 19 delas não gestantes (19/43) e 24 gestantes (24/43), todas sem evidência de doença clínica. Para determinação da fase gestacional foi realizada através das medidas dos fetos. Para análise de uma prévia infecção foram avaliados anticorpos anti-Leptospira,por meio do teste de aglutinação microscópica (MAT). Após a exposição do endométrio,com auxílio de um punch de 8 mm foram retirados fragmentos de endométrio (explantes)foram retirados nas regiões intercarunculares. O processamento dos explantes endometriais ocorreu em placas de cultura celular de 24 poços. As soluções adicionadas sobre os explantes foram as seguintes: a) meio controle, contendo 2 mL de solução de RPMI; b) meio RPMI, contendo 1μg/mL de LPS de Escherichia coli; c) meio EMJH com inóculo de Leptospira interrogans sorovar Hardjoprajitno na concentração de 108 leptospiras por mL. Em seguida,as placas foram incubadas em estufa a 37ºC com 5% de CO2 permanecendo por 24 horas. Após esse período, os tecidos endometriais foram pesados e os sobrenadantes foram recolhidos e subsequentemente testados para determinação dos perfis de produção das interleucinas 1β e 6 pelo Kits de ELISA. Em relação ao desafio com 1μg/mL de LPS, tanto explantes das vacas não gestantes como gestantes montaram uma resposta frente ao desafio, com aumento significativo da produção de IL-6 e IL-1β em relação aos controles. No desafio com Leptospira, os explantes de vacas não gestantes e gestantes, houve aumento na concentração de IL-1β. Entretanto, somente explantes das vacas não gestantes houve aumento de IL-6 em relação aos controles. Na avaliação individual das fases de gestação, somente na fase inicial (primeiro trimestre) ocorreu produção de IL-6 significativa, diferente do observado com IL-1β, sendo que ocorreu diferença significativa na produção desta citocina na fase final de gestação, no desafio com 1μg/mL de LPS de E.coli. Já no desafio com Leptospira não houve diferença significativa entre as fases gestacionais. Conclui-se que ocorre maior estimulação da produção de citocinas do endometrio de vacas reagentes, nos desafios ao LPS e à Leptospira; menor estimulação da produção de IL-6 ao desafio com Leptospira em vacas gestantes; e maior estimulação na fase inicial e final de gestação no desafio com LPS de E.coli e nenhuma diferença significativa entre as fases gestacionais no desafio com Leptospira.

Abstract:

Leptospirosis is a zoonosis caused by a bacteria belonging to genus Leptospira spp. There are reports of this bacteria isolation in the female reproductive tract with are related to abortion and subfertility in bovine herds. It is known that Leptospira presence in reproductive organs of bovines promotes tissue damages especially by vasculitis. Moreover, acute leptospirosis produces high levels of cytokines during the onset of infection. However, few studies were performed about the pathogenesis of this microorganism in the endometrium of cows. The objective of this study was to evaluate the inflammatory cytokines profile after Leptospira interrogans serovars Hardjoprajitno and LPS of Escherichia coli challenges produced by uterine tissue ex vivo of non-pregnant and pregnant cows serologically reactive or not to Microscopic Agglutination Test (MAT). A total of 43 uterus with respective blood samples were collected from crossbred cows, from those 19 were non-pregnant and 24 pregnant, without any clinical disease evidence. To determine the pregnancy phase, the measurement of fetuses were performed. To analyze previous infection occurrence antibodies against Leptospira were evaluated by MAT. After endometrium exposure, fragments of endometrium tissue (explants) were collected using a punch of 8 mm in intercaruncular region. The processing of endometrial explants were done in a 24-well cell culture plates. The solutions added on explants were: a) Control medium (2 mL of RPMI solution); b) RPMI medium (1μg/mL of LPS from Escherichia coli); c) EMJH medium with inoculum of Leptospira interrogans serovars Hardjoprajitno (108 leptospires/mL). The plates were incubated at 37°C with 5% of CO2 for 24 hours. After this period, uterine explants were weighed and collected and subsequently tested for interleukins (IL-1β and IL-6) production profile by ELISA kits. Considering the challenge with 1μg/mL of LPS, both pregnant and non-pregnant cows build a response due to challenge with a significant increase in IL-1β and IL-6 production compared to control group. Considering the challenge with Leptospira, an increase of IL-6 concentration was verified in the explants of both pregnant and non-pregnant cows related to control. However, only the explants from non-pregnant cows showed an increase of IL-6 production related to control. In the individual evaluation of pregnancy phases, during the initial phase (first trimester) only occurred significant IL-6 production, differing from IL-1β which significant production increase occurred during late gestation phase in the challenge with 1μg/mL of LPS from E.coli. There was no difference in cytokines production according to pregnancy phase after challenge with Leptospira. In conclusion, a higher stimulation of cytokines production was verified in endometrial tissues of reagent cows after LPS and Leptospira challenges; lower stimulation of IL-6 production in pregnant cows after Leptospira challenge; a higher stimulation during initial and late pregnancy phases after LPS from E.coli challenge, and no significant difference between pregnancy phases after Leptospira challenge.